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Artículo
Caracterización preliminar de dos fermentos de kéfir de
agua después de cinco días
Preliminary characterization of two water kefir fermentations after five days
Cristian Fernando
Izquierdo
-
Velasco
1
,
Mercedes Susana
Carranza
-
Patiño
2*
,
Patricia Cecibel
Villa Zambrano
3
,
José Xa
vier
Serrano
-
Recalde
4
y
Robinson J
.
Herrera
-
Feijoo
5
1
Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales,
Quevedo, Ecuador;
https://orcid.org/0009
-
0004
-
4088
-
2607
;
cizquierdov2@uteq.edu.ec
2
Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales,
Quev
edo, Ecuador;
https://orcid.org/0000
-
0002
-
0917
-
0415
3
Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales,
Quevedo, Ecuador;
https://orcid.org/0009
-
0003
-
6665
-
6686
;
pvillaz@uteq.edu.ec
4
Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales,
Quevedo, Ecuador;
https://orcid.org/0009
-
0001
-
6774
-
2805
;
josexaviersr14@gmail.com
5
Universidad Técnica Estatal de Quevedo, Facultad de Ciencias Pecuarias, Quevedo,
Ecuador
;
https://orcid.org/0000
-
0003
-
3205
-
2350
;
rherreraf2@uteq.edu.ec
*
C
orrespondencia:
mcarranza@uteq.edu.ec
https://doi.org/10.70881/mcj/v4/n4/
186
R
esumen:
El kéfir de agua es un sistema fermentativo formado por
comunidades de bacterias y
levaduras cuya composición depende del
inóculo y de las condiciones de fermentación. El objetivo fue caracterizar
preliminarmente las propiedades fisicoquímicas, microbiológicas cultivables,
microscópicas y fenotípicas de dos fermentos independientes prep
arados a
partir de un mismo lote de gránulos. Cada unidad se preparó con 40 g de
gránulos, 30 g de panela comercial amarilla y 1 L de agua embotellada, y se
evaluó después de cinco días. En M1 y M2 se determinaron pH y sólidos
solubles mediante tres lectur
as técnicas por muestra; además, se evaluaron
crecimiento en un medio nutritivo de formulación propia, morfología por
tinción de Gram, actividad catalasa y respuesta metabólica exploratoria en
medio con almidón y azul de bromotimol. M1 presentó pH 4,19 y 0
,4 °Brix, y
M2 pH 4,14 y 0,6 °Brix. Ambas muestras mostraron crecimiento cultivable.
En el material cultivado se observaron morfotipos bacilares y cocobacilares,
estructuras compatibles con levaduras y una reacción compatible con
actividad catalasa. El med
io con almidón mostró cambios de color
compatibles con modificación del pH. Estos datos constituyen una línea base
del fermento para ensayos posteriores con más unidades de fermentación y
métodos moleculares.
Palabras clave:
fermentación no láctea; bacteri
as ácido
-
lácticas; levaduras;
panela; tinción de Gram.
Abstract:
Water kefir is a fermentation system composed of bacterial and
yeast communities whose composition depends on the inoculum and
fermentation conditions. This study preliminarily characterized
the
Cita:
Izquierdo
-
Velasco, C. F.,
Carranza
-
Patiño, M. S., Villa
Zambrano, P. C., Serrano
-
Recalde,
J. X., & Herrera
-
Feijoo, R. J. (2026).
Caracterización preliminar de dos
fermentos de kéfir de agua después
de cinco días.
Multidisciplinary
Collaborative Journal
,
4
(4), 95
-
113.
https://doi.org/10.70881/mcj/v4/n4/
186
Recibido:
04
/
09
/20
26
Revisado:
14
/
10
/20
26
Aceptado:
20
/
10
/20
26
Publicado:
09
/
11
/20
26
Copyright:
© 2026 por los autores.
Este artículo es un artículo de
acceso abierto distribuido bajo los
términos y condiciones de la
Licencia
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Atribución
-
NoComercial 4.0 Internacional.
(
CC BY
-
NC
)
.
(
https://creativecommons.org/licens
es/by
-
nc/4.0/
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ph
ysicochemical, culture
-
based microbiological, microscopic, and phenotypic
properties of two independent fermentations prepared from the same batch
of water kefir grains. Each unit contained 40 g of grains, 30 g of commercial
yellow panela, and 1 L of
bottled water and was evaluated after five days. In
M1 and M2, pH and soluble solids were determined from three technical
readings per sample; growth on a laboratory
-
formulated nutrient medium,
morphology by Gram staining, catalase activity, and an explor
atory metabolic
response in a starch medium containing bromothymol blue were also
evaluated. M1 showed pH 4.19 and 0.4 °Brix, whereas M2 showed pH 4.14
and 0.6 °Brix. Both samples exhibited cultivable growth. Bacillary and
coccobacillary morphotypes, struc
tures compatible with yeast cells, and a
reaction consistent with catalase activity were observed in the cultured
material. The starch
-
containing medium showed color changes compatible
with pH modification. These data provide a baseline of the ferment for
further
studies with more fermentation units and molecular methods.
Keywords:
non
-
dairy fermentation; lactic acid bacteria; yeasts; panela; Gram
staining.
1. Introducción
Los alimentos y las bebidas fermentados constituyen sistemas biológicos en los
que la
transformación del sustrato depende de comunidades microbianas
complejas y de sus interacciones metabólicas, razón por la cual sus propiedades
no pueden explicarse únicamente a partir de la materia prima empleada, sino
también de la dinámica de los microo
rganismos que intervienen en el proceso
(Tamang et al., 2016). Dentro de este grupo, el kéfir de agua es una bebida
fermentada no láctea que se obtiene al incubar gránulos translúcidos en una
solución azucarada, los cuales albergan una comunidad simbiótica
de bacterias
y levaduras inmersa en una matriz de exopolisacáridos sintetizados a partir de la
sacarosa disponible en el medio (Fiorda et al., 2017; Lynch et al., 2021). Entre
los grupos microbianos descritos con mayor frecuencia en estos gránulos se
encu
entran las bacterias ácido
-
lácticas, las levaduras y las bacterias ácido
-
acéticas, aunque su abundancia relativa y la identidad de las especies
dominantes varían de manera considerable entre cultivos de distinta procedencia
y entre condiciones de elaboraci
ón (Gulitz et al., 2011; Pendón et al., 2022). De
igual modo, el aislamiento de bacterias ácido
-
lácticas productoras de dextrano a
partir de gránulos de kéfir de agua confirma que una fracción relevante de la
comunidad es capaz de sintetizar exopolisacárid
os a partir de sacarosa,
propiedad que sustenta la formación de la matriz del gránulo y su mantenimiento
como inóculo reutilizable (Davidović et al., 2015).
Los gránulos de kéfir de agua funcionan como un consorcio microbiano en el que
diferentes poblacion
es participan de forma coordinada en la utilización de los
carbohidratos y en la formación de metabolitos como etanol, ácido láctico, ácido
acético, glicerol, manitol y dióxido de carbono, cuya acumulación determina la
acidez y las características de la be
bida (Laureys & De Vuyst, 2014; Lynch et al.,
2021). Esta organización responde a interacciones tróficas de tipo mutualista,
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p
uesto que las levaduras liberan aminoácidos y vitaminas que favorecen el
crecimiento de los lactobacilos, mientras que la acidific
ación generada por estos
últimos crea condiciones favorables para determinadas levaduras del consorcio
(Stadie et al., 2013). Por consiguiente, las propiedades de la bebida resultante
dependen no solo de la presencia de determinados grupos microbianos, sin
o
también del origen del inóculo, que condiciona la cinética fermentativa y las
características del producto obtenido con gránulos de diferente procedencia
(Laureys & De Vuyst, 2017). A ello se suma que factores operativos como la
disponibilidad de oxígeno
y de nutrientes, la capacidad tampón y el contenido de
calcio del agua, el tiempo de retroinoculación y la temperatura de incubación
modifican el desarrollo de la fermentación y la diversidad de especies presentes
(Laureys et al., 2018, 2019, 2022).
El su
strato azucarado constituye otra fuente de variación, ya que la sustitución
de la sacarosa refinada por fuentes no convencionales, como azúcares
mínimamente procesados, frutas o extractos vegetales, modifica la acidificación,
el consumo de azúcares y las c
aracterísticas microbiológicas del fermento
obtenido (Gökırmaklı et al., 2023; Lima et al., 2024; Tavares et al., 2023). En este
sentido, la panela o azúcar no centrifugado de caña conserva, además de la
sacarosa predominante, pequeñas proporciones de gluc
osa y fructosa junto con
compuestos fenólicos, flavonoides, minerales y vitaminas, cuya presencia la
distingue del azúcar refinado como medio de fermentación (Alarcón et al., 2021;
Jaffé, 2015). En consecuencia, los valores de pH y de sólidos solubles obte
nidos
con un edulcorante determinado no pueden extrapolarse a otros sustratos, dado
que el tipo y la concentración del azúcar, junto con la relación entre inóculo y
sustrato, modifican el perfil fisicoquímico y la cinética de la fermentación (Laureys
et al
., 2021; Lima et al., 2024). Asimismo, la temperatura de incubación y las
propiedades del agua empleada influyen en los parámetros fisicoquímicos y
sensoriales del producto final, de modo que la caracterización de un fermento
debe referirse siempre a las c
ondiciones concretas bajo las cuales fue elaborado
y mantenido (Laureys et al., 2022; Tireki, 2025).
La variabilidad entre cultivos representa un aspecto central para la
caracterización del kéfir de agua, puesto que el análisis de muestras procedentes
de diferentes fuentes ha revelado comunidades microbianas distintas, y los
estudios metagenómicos han evi
denciado una diversidad que no puede
resolverse mediante rasgos macroscópicos o microscópicos (Marsh et al., 2013;
Verce et al., 2019). Del mismo modo, las aproximaciones basadas en
secuenciación y en enfoques multiómicos han documentado cambios en la
comp
osición microbiana durante la fermentación y diferencias entre microbiomas
de distinto origen, lo que pone de manifiesto procesos de selección ecológica no
observables mediante cultivo convencional (Arrieta
-
Echeverri et al., 2023;
Garmendia et al., 2026; W
ilches
-
López et al., 2023). Por esta razón, los
resultados obtenidos mediante cultivo, tinción y pruebas fenotípicas deben
interpretarse según el nivel de resolución de dichas técnicas, ya que los medios
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e cultivo recuperan solo una parte de la diversidad
microbiana presente y
pueden omitir microorganismos no cultivables con funciones relevantes en el
proceso (Amann et al., 1995; Tamang et al., 2016). En particular, la tinción de
Gram permite describir la morfología celular y la respuesta diferencial de la
envoltura celular, pero su resultado puede variar con la edad del cultivo y con la
ejecución del procedimiento, por lo que no sustituye a los métodos específicos
de identificación taxonómica (Beveridge, 2001).
En Ecuador, Monar et al. (2014) caracterizaro
n kéfir de agua artesanal elaborado
con distintos endulzantes y tiempos de fermentación mediante variables
químicas y microbiológicas, y su trabajo constituye un antecedente regional que
demuestra la utilidad de integrar ambos tipos de indicadores en la de
scripción de
estos fermentos. No obstante, las características de un fermento particular
dependen de su formulación, de su inóculo y de las condiciones de
procesamiento, por lo que los resultados obtenidos en un sistema no pueden
transferirse directamente
a otros cultivos ni a otros sustratos, como advierten las
revisiones sobre la variabilidad del kéfir de agua (Lynch et al., 2021; Pendón et
al., 2022). Por otra parte, los fermentados que contienen bacterias ácido
-
lácticas
se han utilizado en sistemas agrí
colas para mejorar el suelo, controlar
enfermedades y promover el crecimiento vegetal, aunque las funciones de estos
microorganismos en el fitomicrobioma y la consistencia de sus efectos aún
requieren validación experimental (Lamont et al., 2017; Raman et
al., 2022). En
esa línea, la aplicación de sobrenadantes de kéfir lácteo en plantas de frijol y de
pepino bajo condiciones controladas incrementó algunos parámetros de
crecimiento aéreo y radical, lo que sugiere un potencial agronómico de los
productos der
ivados del kéfir que exige conocer previamente las características
del fermento aplicado (Taşkın & Akköprü, 2020).
En este contexto, nuestro grupo emplea fermentos de kéfir de agua elaborados
con panela en ensayos con plántulas de cacao y de tomate, de man
era que
conocer su acidez, su contenido de sólidos solubles y los grupos microbianos
cultivables en el momento de su uso constituye un requisito para interpretar las
respuestas vegetales, dado que la composición de estos fermentos no es
constante (Laureys
et al., 2021; Lynch et al., 2021). La novedad del presente
trabajo radica en que proporciona una línea base fisicoquímica, microbiológica y
fenotípica de un fermento de kéfir de agua de origen ecuatoriano preparado con
panela comercial, sustrato menos docu
mentado que la sacarosa refinada y que
otros edulcorantes alternativos evaluados en la literatura (Lima et al., 2024;
Monar et al., 2014; Tavares et al., 2023). Su relevancia reside en que esta
información permite trazar el fermento que posteriormente se a
plica como
insumo experimental en plantas, en coherencia con la necesidad de caracterizar
los productos fermentados con bacterias ácido
-
lácticas antes de atribuirles
efectos sobre el crecimiento vegetal (Lamont et al., 2017; Raman et al., 2022).
Asimismo,
una caracterización que integre variables fisicoquímicas, crecimiento
cultivable, observación microscópica y respuestas fenotípicas orienta la
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n
ecesidad posterior de recuentos validados, aislamiento de cepas y
herramientas moleculares, que son las que ofre
cen resolución taxonómica y
funcional en este tipo de consorcios (Arrieta
-
Echeverri et al., 2023; Verce et al.,
2019). Por consiguiente, el objetivo de este estudio fue caracterizar de forma
preliminar las propiedades fisicoquímicas, microbiológicas cultiv
ables,
microscópicas y fenotípicas de dos fermentos de kéfir de agua, preparados a
partir de un mismo lote de inóculo y evaluados después de cinco días bajo
condiciones similares de laboratorio.
2. Materiales y métodos
2.1. Diseño y alcance del estudio
Se
realizó un estudio descriptivo y exploratorio orientado a la caracterización
preliminar de dos fermentos de kéfir de agua. Los gránulos procedieron de la
provincia de Los Ríos, Ecuador, y se mantuvieron en frascos de vidrio bajo un
mismo sistema de conserv
ación. M1 y M2 correspondieron a dos unidades de
fermentación independientes, preparadas con gránulos procedentes del mismo
lote de inóculo y evaluadas al quinto día.
Los dos frascos se consideraron repeticiones biológicas de una misma condición
de ferment
ación. M1 y M2 no representaron tiempos diferentes ni mediciones
sucesivas de un mismo recipiente. Las tres lecturas efectuadas para cada
variable fisicoquímica fueron repeticiones técnicas y no unidades experimentales
adicionales.
El número limitado de un
idades experimentales definió el alcance descriptivo del
estudio. Por esta razón, no se aplicaron pruebas de inferencia estadística ni se
formularon comparaciones destinadas a establecer diferencias significativas
entre M1 y M2.
2.2. Condiciones de manteni
miento y fermentación
Los gránulos de kéfir de agua se conservaron en frascos de vidrio y el medio de
mantenimiento se renovó cada cinco días. Cada unidad de fermentación se
preparó de manera independiente con 40 g de gránulos, 30 g de panela
comercial ama
rilla y 1 L de agua embotellada, equivalentes a 40 g/L de gránulos
y 30 g/L de panela. Los recipientes se ubicaron en estantes del laboratorio a una
temperatura ambiente aproximada de 24
–
26 °C, se protegieron de la luz directa
con cartón oscuro y se cubrie
ron con papel absorbente, sin cierre hermético.
Los dos frascos se mantuvieron bajo las mismas condiciones generales de
laboratorio durante cinco días. Al finalizar este periodo se obtuvieron las
muestras M1 y M2 para la caracterización fisicoquímica, micr
obiológica y
fenotípica.
El estudio se ejecutó en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad
Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ), en la ciudad de Quevedo, Ecuador.
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2.3. Obtención de las muestras
Al quinto día de fermentación se obtuvo una
muestra de cada uno de los dos
frascos, identificándose como M1 la procedente del primer frasco y como M2 la
procedente del segundo.
Previamente a la toma de la fracción líquida, cada recipiente fue agitado
manualmente y posteriormente dejado en reposo par
a permitir la sedimentación
gravitacional de los gránulos de kéfir. Una vez sedimentados los gránulos, se
tomó la fracción líquida ubicada sobre estos para las determinaciones
fisicoquímicas y microbiológicas.
La fracción líquida se separó únicamente por s
edimentación, sin centrifugar ni
filtrar.
2.4. Caracterización fisicoquímica
En la fracción líquida de cada fermento se determinaron el pH y los sólidos
solubles expresados en °Brix. Para cada variable se efectuaron tres lecturas
técnicas por muestra y se
calculó el promedio. El pH se midió con un medidor de
mesa Ohaus AquaSearcher AB33M1, con rango de
-
2,00 a 20,00 unidades de
pH y resolución de 0,01. El equipo se calibró diariamente antes de las mediciones
con soluciones amortiguadoras estándar de pH 4,01
, 7,00 y 10,01 y estuvo sujeto
al programa institucional de mantenimiento preventivo. Los sólidos solubles se
determinaron con un refractómetro digital de bolsillo Atago PAL
-
3, con rango de
0,0 a 93,0 °Brix y resolución de 0,1 °Brix; el equipo se ajustó a
cero con agua
destilada antes del análisis. Las mediciones se realizaron a temperatura
ambiente y los registros automáticos de los equipos se situaron entre 25,0 y 28,7
°C. Las tres lecturas por muestra se consideraron repeticiones técnicas.
Las lecturas s
e utilizaron para obtener el promedio de cada fermento y no para
incrementar el número de unidades experimentales. Entre mediciones, el
electrodo y el prisma se enjuagaron minuciosamente con agua destilada y se
secaron con papel absorbente para reducir el
riesgo de contaminación cruzada.
2.5. Caracterización microbiológica y fenotípica
M1 y M2 se sometieron a cultivo en un medio nutritivo de formulación propia,
similar al
Plate Count Agar
(en adelante, medio PCA
-
m), tinción de Gram y
observación microscópic
a, prueba de catalasa y un ensayo fenotípico
exploratorio en medio con almidón. Para el procesamiento microbiológico se
tomó 1 mL de cada muestra y se prepararon diluciones seriadas en agua
destilada esterilizada, transfiriendo 100 µL de la dilución previa
a 900 µL de
diluyente, desde 10
¹
hasta 10
¹⁰
. Para el seguimiento cualitativo en las placas
representativas se inocularon 10 µL de la muestra madre por cuadrante, para un
total de 40 µL por placa y una placa representativa por muestra. De forma
paralela,
las diluciones 10
³
a 10
¹⁰
se sembraron con el fin de estimar la carga
microbiana; sin embargo, el número de colonias no disminuyó de forma
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p
rogresiva y consistente entre diluciones sucesivas, por lo que no se calcularon
unidades formadoras de colonias (
UFC/mL).
El medio PCA
-
m contuvo, por litro, 1,5 g de extracto de levadura, 1 g de leche
en polvo, 2 g de peptona, 1 g de glucosa, 15 g de agar
-
agar y 1000 mL de agua
destilada. La inoculación cualitativa se realizó mediante estriado por cuadrantes.
La siem
bra se realizó en placas Petri de plástico, que se sellaron con Parafilm y
se incubaron a 28 °C durante 72 h, en oscuridad y en posición invertida. El
crecimiento se documentó visual y fotográficamente al momento de la siembra y
a las 24, 48 y 72 h. Las co
lonias se observaron con estereoscopio.
La tinción de Gram se efectuó sobre material procedente del crecimiento
obtenido en el medio PCA
-
m. Se extendió una pequeña cantidad de crecimiento
sobre un portaobjetos y se aplicaron cristal violeta durante 1 min,
Lugol durante
1 min, alcohol
-
acetona durante 15 s y safranina durante 1 min, con enjuagues
con agua entre etapas. Las preparaciones se examinaron con un microscopio
OHAUS, utilizando un objetivo de 100× y aceite de inmersión. Las observaciones
se interpret
aron en términos de morfología celular y respuesta diferencial a la
tinción, sin asignación taxonómica.
La actividad catalasa se evaluó sobre material cultivado en el medio PCA
-
m
mediante la adición de una gota de peróxido de hidrógeno de 10 volúmenes
(apr
oximadamente 3 % de H
O
).
Se consideró positiva la formación inmediata
de burbujas. El ensayo no incluyó controles positivo ni negativo. Se realizaron
tres repeticiones de la prueba por cada placa seleccionada, para un total de seis
determinaciones corres
pondientes a las dos muestras. Debido a la naturaleza
mixta del crecimiento, la respuesta se atribuyó al material cultivado y no a una
especie determinada.
2.6. Ensayos fenotípicos exploratorios
El ensayo con almidón se realizó en un medio con azul de brom
otimol como
indicador de pH. El medio se preparó, por litro, con 2 g de leche, 2 g de almidón,
15 g de agar
-
agar y 1600 µL de azul de bromotimol; se elaboraron
aproximadamente 150 mL, que se distribuyeron en tubos previamente
esterilizados (aproximadamente
15 mL por tubo) y se esterilizaron nuevamente
antes de la inoculación. El azul de bromotimol se utilizó como indicador de pH,
considerando su coloración verde en condiciones cercanas a la neutralidad,
amarilla en condiciones ácidas y azulada en condicione
s alcalinas. Cada tubo se
inoculó mediante transferencia de material proveniente de colonias desarrolladas
previamente en el medio PCA
-
m, utilizando un asa bacteriológica de mango
intercambiable con una punta larga para introducir el inóculo en el interior
del
tubo. La incubación se realizó a 28 °C durante 72 horas, en las mismas
condiciones de laboratorio empleadas para el cultivo en el medio PCA
-
m, con los
tubos mantenidos en oscuridad.
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S
e incluyeron dos controles, correspondientes a un control de inóculo y un
control de pH neutro (pH 7), este último con coloración verde; la composición del
control de inóculo no quedó documentada en el registro experimental. Se trabajó
con tres repeticion
es para M1 y tres repeticiones para M2, para un total de ocho
tubos, incluidos los dos controles. El cambio de color del indicador se interpretó
como evidencia de modificación del pH del medio. La acidificación observada se
consideró un resultado fenotípic
o exploratorio y no una demostración específica
de la hidrólisis del almidón, debido a que el cambio de pH puede estar asociado
a diferentes procesos metabólicos del crecimiento microbiano, entre ellos la
utilización de los componentes de la leche incorpor
ada al medio.
2.7. Análisis de la información
Los datos se analizaron de forma descriptiva; los valores fisicoquímicos
corresponden al promedio de tres lecturas técnicas por fermento.
2.8. Consideraciones éticas
El estudio se realizó exclusivamente con fer
mentos de kéfir de agua y no
involucró participantes humanos ni animales.
3. Resultados
3.1. Características fisicoquímicas de los fermentos
Las muestras M1 y M2 presentaron valores de pH próximos entre sí: 4,19 y 4,14,
respectivamente. Los sólidos soluble
s fueron de 0,4 °Brix en M1 y 0,6 °Brix en
M2 (Tabla 1).
Tabla 1
Características fisicoquímicas de dos fermentos de kéfir de agua después de
cinco días de fermentación
Muestra
Procedencia
Tiempo de
fermentación
pH
Sólidos
solubles (°Brix)
M1
Frasco 1
5
días
4,19
0,4
M2
Frasco 2
5 días
4,14
0,6
Nota.
Los valores de pH y sólidos solubles corresponden al promedio de tres mediciones técnicas
por muestra. M1 y M2 proceden de dos frascos independientes mantenidos bajo las mismas
condiciones.
3.2.
Crecimiento microbiológico en medio PCA
-
m
Las muestras M1 y M2 presentaron crecimiento microbiológico en el medio PCA
-
m (Figura 1). El seguimiento de las placas permitió observar el desarrollo de
colonias durante el periodo de incubación y su
posterior visualización mediante
estereoscopio.
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Figura 1
Crecimiento microbiológico de M1 y M2 en medio PCA
-
m
Nota.
Seguimiento del crecimiento: (A) siembra, 0 h; (B) 24 h; (C) 48 h; (D) 72 h. Izquierda: M1
(PCA
-
K1); derecha: M2 (PCA
-
K2). Fotografías ori
ginales del estudio.
3.3. Caracterización microscópica del crecimiento cultivable
La tinción de Gram y la observación microscópica del material recuperado en el
medio PCA
-
m evidenciaron heterogeneidad morfológica en el crecimiento
cultivable (Figura 2). Al
gunas preparaciones mostraron predominio de bacilos
Gram positivos (Figura 2A), mientras que otras presentaron predominio de
bacilos y cocobacilos Gram negativos, acompañados de pequeñas agrupaciones
Gram positivas (Figura 2B). Asimismo, se registraron est
ructuras de mayor
tamaño, teñidas con cristal violeta y de morfología compatible con levaduras,
junto a bacilos de respuesta Gram variable (Figura 2C).
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Figura 2
Características microscópicas del crecimiento cultivable
Nota.
(A) Bacilos con respuesta pred
ominantemente Gram positiva; (B) bacilos y cocobacilos con
respuesta predominantemente Gram negativa, con pequeñas agrupaciones Gram positivas; (C)
bacilos de respuesta Gram variable y estructuras de mayor tamaño compatibles con levaduras.
Las micrografías
corresponden a material representativo recuperado del medio PCA
-
m de M1 y
M2 y observado con objetivo de 100× y aceite de inmersión; el registro no permite atribuir cada
panel a una muestra concreta. Fotografías originales del estudio. Las observaciones n
o se
utilizaron para asignación taxonómica.
3.4. Actividad catalasa en el material cultivado
Las seis determinaciones de catalasa, tres por muestra, mostraron formación
inmediata de burbujas después de la adición de peróxido de hidrógeno, una
respuesta com
patible con actividad catalasa en el material cultivado (Figura 3A
–
B). La ausencia de controles positivo y negativo limita la validación del ensayo.
3.5. Respuesta metabólica en medio con almidón
Durante el seguimiento del ensayo en medio con almidón y azul de bromotimol,
los seis tubos inoculados con material procedente de los cultivos en el medio
PCA
-
m mostraron un viraje progresivo del indicador de verde a amarillo,
incipiente a las 24 h en la p
orción superior del medio y extendido a la mayor parte
del tubo a las 72 h, mientras que los tubos control conservaron la coloración
verde (Figura 3C
–
E).
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Figura 3
Caracterización fenotípica del material cultivado
Nota.
(A
–
B) Reacción de catalasa correspo
ndiente a M1 (A) y M2 (B). (C
–
E) Seguimiento del
ensayo exploratorio en medio con almidón a las 24 h (C), 48 h (D) y 72 h (E). En los paneles C,
D y E, la disposición de los tubos es: tubos 1
–
2 (controles), tubos 3
–
5 (réplicas de M1) y tubos
6
–
8 (réplicas
de M2). Fotografías originales del estudio.
4. Discusión
El objetivo de este estudio fue caracterizar de forma preliminar dos fermentos de
kéfir de agua elaborados con panela, y el hallazgo más destacable fue que
ambos alcanzaron al quinto día un medio áci
do (pH 4,14
–
4,19) con bajo
contenido residual de sólidos solubles (0,4
–
0,6 °Brix) y una fracción cultivable
morfológicamente heterogénea, rasgos coherentes con un consorcio
fermentativo (Lynch et al., 2021). Este resultado es relevante porque el fermento
c
aracterizado se emplea en ensayos con plantas, y la literatura advierte que la
composición del kéfir de agua cambia con el inóculo, el sustrato y las condiciones
de producción, de modo que su uso experimental exige una descripción previa
del material aplic
ado (Laureys et al., 2021; Pendón et al., 2022). Sin embargo, la
ausencia de mediciones iniciales impide cuantificar la acidificación y el consumo
de azúcares durante el periodo de fermentación, y la naturaleza cultivable y
fenotípica de los análisis limit
a la resolución taxonómica alcanzada frente a los
enfoques moleculares (Amann et al., 1995; Verce et al., 2019). Por ello, resulta
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n
ecesario continuar esta línea de investigación con más unidades de
fermentación, muestreos temporales y métodos moleculares
que permitan
vincular la composición del fermento con los efectos observados en cultivos
como el cacao y el tomate (Arrieta
-
Echeverri et al., 2023; Lamont et al., 2017).
4.1. Características fisicoquímicas de los fermentos
La condición ácida observada conc
uerda con la naturaleza fermentativa descrita
para el kéfir de agua. Lynch et al. (2021) señalan que los gránulos de kéfir de
agua constituyen una comunidad simbiótica de bacterias y levaduras y que entre
sus integrantes principales se encuentran bacterias
ácido
-
lácticas, levaduras y
bacterias ácido
-
acéticas. Estos microorganismos participan en transformaciones
del sustrato que generan, entre otros productos, ácidos orgánicos, etanol y
dióxido de carbono. No obstante, la composición y el comportamiento del
sistema
dependen del cultivo, el sustrato y las condiciones de producción, por lo que los
valores obtenidos en M1 y M2 deben interpretarse como propios de los fermentos
estudiados y no como valores universales del kéfir de agua. En términos
numéricos, Laur
eys y De Vuyst (2014) registraron un descenso del pH de 4,26 a
3,45 durante las primeras 72 h, y de Carvalho Alves et al. (2024) informaron
valores entre 3,52 y 4,29 en bebidas de extracto de licurí fermentadas con
gránulos de kéfir de agua. El pH de M1 y
M2 se sitúa en el extremo superior de
ese intervalo, lo que podría relacionarse con la baja concentración de panela
empleada (30 g/L); esta hipótesis requiere mediciones de azúcares y ácidos
orgánicos para verificarse.
Los valores finales de °Brix represen
tan sólidos solubles totales y no
concentraciones específicas de sacarosa, glucosa o fructosa. En consecuencia,
no permiten calcular el consumo de azúcares ni atribuir la diferencia numérica
entre M1 y M2 a una actividad metabólica distinta. Estudios exper
imentales
muestran que el perfil fisicoquímico del kéfir de agua varía con el sustrato, el tipo
de azúcar, el agua, el inóculo, el oxígeno, la temperatura y el manejo de los
gránulos (Gökırmaklı et al., 2023; Güzel
-
Seydim et al., 2023; Laureys & De Vuyst,
2014; Laureys et al., 2019, 2021, 2022; Lima et al., 2024; Sin et al., 2024; Tavares
et al., 2023; Tireki, 2025). Por ello, los valores de M1 y M2 se interpretan
únicamente como mediciones finales de los fermentos estudiados.
En el contexto ecuatoriano, Mo
nar et al. (2014) estudiaron kéfir de agua artesanal
elaborado con diferentes endulzantes y tiempos de fermentación y evaluaron
variables químicas, entre ellas °Brix, junto con características microbiológicas.
Este antecedente resulta pertinente porque dem
uestra la utilidad de combinar
indicadores fisicoquímicos y microbiológicos en la caracterización de kéfir de
agua de origen ecuatoriano. Sin embargo, su diseño experimental, los sustratos
y los tiempos evaluados difieren de los utilizados en el presente e
studio, por lo
que sus resultados no se emplean como valores de referencia directa para M1 y
M2. Además, la panela conserva glucosa, fructosa, minerales y compuestos
fenólicos junto con la sacarosa, lo que la diferencia del azúcar refinado empleado
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n buen
a parte de los estudios de referencia y constituye otra razón para no
extrapolar directamente los valores publicados a los fermentos aquí
caracterizados (Alarcón et al., 2021; Jaffé, 2015).
4.2. Crecimiento cultivable y morfología microscópica
El crecimien
to observado en el medio PCA
-
m en las dos muestras evidencia la
presencia de microorganismos viables capaces de desarrollarse bajo las
condiciones de cultivo utilizadas. Este hallazgo es coherente con la naturaleza
microbiológicamente compleja del kéfir de
agua. Mediante secuenciación
metagenómica, Verce et al. (2019) demostraron que un ecosistema de kéfir de
agua podía albergar simultáneamente diferentes bacterias y levaduras. No
obstante, el crecimiento en el medio PCA
-
m del presente estudio representa
ún
icamente la fracción cultivable recuperada bajo las condiciones empleadas y
no permite describir la totalidad de la comunidad microbiana, dado que los
medios de cultivo omiten microorganismos no cultivables presentes en los
alimentos fermentados (Amann et
al., 1995; Tamang et al., 2016).
La observación microscópica mostró estructuras bacilares y cocobacilares,
además de células de mayor tamaño compatibles con levaduras. Esta
heterogeneidad morfológica concuerda, de forma general, con la naturaleza
consorcia
l del kéfir de agua (Lynch et al., 2021; Verce et al., 2019). La
coexistencia de morfotipos Gram positivos y Gram negativos es coherente con
la presencia descrita en el kéfir de agua de bacterias ácido
-
lácticas, Gram
positivas, y de bacterias ácido
-
acética
s, Gram negativas (Gomes et al., 2018;
Lynch et al., 2021; Mokoena et al., 2021). Sin embargo, la concordancia
morfológica no constituye identificación taxonómica. La tinción de Gram no
permite asignar los microorganismos observados a géneros o especies
pa
rticulares (Beveridge, 2001).
Esta delimitación es necesaria al comparar los resultados con estudios que
aplicaron herramientas de mayor resolución. Monar et al. (2014) combinaron la
caracterización fenotípica con ADNr 16S, mientras que Verce et al. (2019)
,
Arrieta
-
Echeverri et al. (2023), de Carvalho Alves et al. (2024) y Garmendia et al.
(2026) utilizaron enfoques moleculares o multi
-
ómicos. Las identificaciones
comunicadas en esos trabajos no pueden trasladarse a los morfotipos
observados en M1 y M2. En
consecuencia, la confirmación de los grupos
sugeridos por la morfología requerirá aislamiento en medios selectivos e
identificación molecular, tal como se ha realizado en estudios que describieron
la diversidad del kéfir de agua mediante secuenciación de g
enes ribosomales
(Gulitz et al., 2011; Marsh et al., 2013).
4.3. Actividad catalasa y respuesta metabólica en medio con almidón
La formación inmediata de burbujas después de la adición de peróxido de
hidrógeno fue compatible con actividad catalasa en el ma
terial recuperado en el
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m
edio PCA
-
m. Debido a que la prueba se realizó sobre crecimiento
microbiológico mixto y no sobre aislamientos purificados e identificados, esta
respuesta se interpreta de forma exploratoria para el material cultivado en
conjunto. La
ausencia de controles positivo y negativo limita la validación del
ensayo. Por la misma razón, la reacción no puede utilizarse para atribuir
actividad catalasa a ninguno de los morfotipos observados ni para identificar
grupos microbianos concretos. Adicio
nalmente, las bacterias ácido
-
lácticas se
describen como microorganismos catalasa negativos (Mokoena et al., 2021); por
ello, la reacción positiva sugiere la contribución de otros componentes del
crecimiento mixto, como las células levaduriformes o los mor
fotipos Gram
negativos observados, hipótesis que requiere confirmarse con aislamientos
purificados.
El ensayo exploratorio realizado en medio con almidón mostró un viraje del
indicador que refleja cambios en las condiciones ácido
-
base del medio. Este
compo
rtamiento constituye evidencia de actividad metabólica en el material
inoculado; sin embargo, el indicador utilizado no demuestra específicamente la
hidrólisis del almidón. En consecuencia, el resultado se interpreta como
modificación del medio asociada co
n actividad metabólica y no como
confirmación de actividad amilolítica. Además, el medio contenía leche, cuyo
aprovechamiento microbiano también puede generar acidificación; la
confirmación de actividad amilolítica requiere revelar el almidón residual con
solución de yodo (Lugol) y verificar la formación de halos de hidrólisis alrededor
del crecimiento.
4.4. Limitaciones y líneas futuras
Las principales limitaciones fueron el número reducido de unidades de
fermentación, la ausencia de una línea basal fisico
química, la falta de una
estimación cuantitativa confiable de la carga microbiana y la ausencia de
identificación molecular. Además, el registro experimental no conservó el
volumen utilizado en cada lectura fisicoquímica, los modelos del microscopio y
del
estereoscopio, la condición atmosférica de incubación, la concentración y el
disolvente de la solución de azul de bromotimol, el tipo de leche incorporada al
medio con almidón, las condiciones de esterilización de ese medio ni la
composición del control de
inóculo. Un ensayo exploratorio de ureasa se excluyó
del análisis porque el medio se preparó con sulfato de amonio en lugar de urea,
lo que impidió una interpretación válida. Estas condiciones limitan la
reproducibilidad instrumental y no permiten estimar
abundancias, identificar
taxones o generalizar los hallazgos a otros cultivos de kéfir de agua.
Los resultados sugieren un sistema fermentativo microbiano mixto, aunque no
identifican su composición ni reconstruyen su dinámica durante los cinco días.
El e
studio aporta un registro preliminar del material analizado y define los
procedimientos que requieren estandarización en una fase posterior. En estudios
posteriores convendría ampliar el número de fermentaciones independientes,
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inco
rporar mediciones basale
s y muestreos temporales, estandarizar un
procedimiento cuantitativo de recuento microbiológico y complementar la
caracterización con aislamiento de cultivos y métodos moleculares. Estas
estrategias permitirían evaluar variación entre unidades, dinámica fe
rmentativa
y composición microbiana con mayor resolución.
5. Conclusiones
Los fermentos de kéfir de agua mantenidos en el laboratorio presentan, al quinto
día, un medio ácido (pH 4,14
–
4,19) con bajo contenido residual de sólidos
solubles (0,4
–
0,6 °Brix). A
simismo, la fracción cultivable mostró morfotipos
bacilares y cocobacilares, estructuras compatibles con levaduras y una reacción
compatible con actividad catalasa. El cambio de coloración en el medio con
almidón indicó una modificación ácido
-
base, pero no
demostró actividad
amilolítica específica. Estos resultados sirven como línea base del fermento que
el grupo aplica en ensayos con plantas. La siguiente etapa requiere más
unidades de fermentación, mediciones iniciales y recuentos en medios selectivos
par
a bacterias ácido
-
lácticas y levaduras.
Contribución de los autores:
Conceptualización: M.S.C.P. Metodología:
M.S.C.P. Análisis formal: M.S.C.P. Investigación: C.F.I.V., P.C.V.Z. y J.X.S.R.
Curación de datos: R.J.H.F. Redacción del borrador original: M.S.C.P.
Redacción (revisión y edición): M.S.C.P. y R.J.H.F. Supervisión:
M.S.C.P.
Administración del proyecto: M.S.C.P. Todos los autores han leído y aceptado la
versión publicada del manuscrito.
Financiamiento:
La investigación contó con el apoyo de la universidad mediante
la disponibilidad de infraestructura, equipos y mater
iales de laboratorio. Los
reactivos fueron adquiridos con recursos propios de los autores. No se recibió
financiamiento externo.
Agradecimientos:
Los autores agradecen a los técnicos de laboratorio por su
apoyo y colaboración durante el desarrollo de las a
ctividades experimentales de
esta investigación.
Declaración de disponibilidad de datos:
Los datos que sustentan los
resultados de esta investigación constan en el informe del estudio y están
disponibles previa solicitud a la autora de correspondencia:
mcarranza@uteq.edu.ec
Conflicto de Intereses:
Los autores declaran no tener ningún conflict
o de
intereses que pudiera haber influido en el diseño, ejecución o resultados del
presente estudio.
Uso de inteligencia artificial:
Se emplearon herramientas de inteligencia
artificial generativa únicamente como apoyo en la edición de estilo, organización
del manuscrito y verificación formal. No se utilizaron para generar datos
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xperimentales, resultados ni observaciones de laboratorio. La responsabilidad
sobre el contenido científico y la versión final corresponde al equipo autoral.
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